El procedimiento para realizar una tinción es el siguiente: lo primero es tomar la muestra de bacterias que se busca colorear, luego con un hisopo se debe extender en un portaobjetos y luego se debe dejar secar a temperatura ambiente o en su defecto utilizar un mechero, teniendo especial cuidado para no quemar las bacterias. Luego de eso se debe fijar la muestra en el portaobjetos utilizando para ello metanol durante aproximadamente 1 minuto.
Posteriormente se coloca el tinte de color violeta de genciana en el portaobjetos y se deja reposar por 1 minuto. Es importante destacar que este colorante tiene la capacidad de traspasar cualquier tipo de pared bacteriana y es por ello que puede teñir tanto bacterias Gram positivas como negativas. Posterior a ello se debe enjuagar la muestra con agua y seguidamente agregar Lugol, de manera que dicha sustancia cubra toda la muestra y se espera durante un minuto. El lugol es un compuesto que está conformado en gran parte por yodo que en este caso es el responsable de fijar el colorante violeta de genciana a la muestra.
Luego de los pasos antes descritos el portaobjetos debe lavarse con una mezcla de alcohol y acetona durante un periodo aproximado de 30 días, es en este paso, cuando realmente termina la tinción de Gram, esto se debe a que la mezcla de alcohol y acetona se encarga de disolver los complejos de lugol y violeta de genciana.
